Книга: Интернет: Заметки научного сотрудника

28. Целлюлоза и ее ферментативный гидролиз. Биотехнология целлюлозы

28. Целлюлоза и ее ферментативный гидролиз. Биотехнология целлюлозы

Началась эта история во время Второй мировой войны. Американские войска, базировавшиеся на тихоокеанских островах Юго-Восточной Азии, неожиданно подверглись нападению невидимого противника. Потерь в живой силе не было, но обмундирование, палатки, гаражные тенты, брезентовые ремни и патронташи, пилотки и прочие хлопковые и хлопчатобумажные изделия стали рассыпаться в труху. Командование посылало конвой за конвоем с новым обмундированием, но его хватало ненадолго. Сначала заподозрили японцев, но это было бы слишком невероятно. Армия забила тревогу, и на острова направили специалистов-ученых, чтобы разобраться в ситуации. Те разобрались.

Оказалось, во всем виноваты микроорганизмы, разрушающие целлюлозу. А поскольку целлюлоза и есть главная (и практически единственная) составляющая хлопка, то те же микроорганизмы и разрушали хлопковые изделия. Эти микроорганизмы были известны с конца XIX века, но никто не наблюдал столь активных микробов, которые уничтожали целлюлозу буквально на глазах. Именно такие микробы, как выяснилось, широко распространены во влажном тропическом климате Юго-Восточной Азии. Было создано несколько армейских лабораторий, перед которыми поставили задачу – детально исследовать причины разложения целлюлозы, идентифицировать наиболее активные микроорганизмы, выявить способ их действия и найти эффективное «противоядие».

За несколько лет эти армейские лаборатории США изучили свыше 10 тысяч разных микроорганизмов. Масштабы этой работы можно представить, если понять, что пробу каждого микрорганизма наносили на полоску хлопкового материала, выращивали, повторяли для разных количеств нанесенного микрорганизма и тестировали каждую из десятков тысяч этих полосок на потерю прочности. Таким образом нашли самый разрушительный микроорганизм из группы «целлюлолитических», то есть «растворяющих целлюлозу». Он получил соответствующее латинское название, Trichoderma viride, где «триходерма» идентифицирует семейство микробов, а «вириде» – его конкретный представитель.

Потом эти армейские лаборатории свели в одну, которая была переведена в городок Нейтик штата Массачусетс, в составе Армейского исследовательского центра, который там, в Нейтике, и находится по сей день. А микроб был переименован в честь Элвина Риза, руководителя этих исследований на протяжении более 40 лет и моего хорошего приятеля. К сожалению, Элвин умер пятнадцать лет назад в возрасте хорошо за восемьдесят. Но даже будучи за восемьдесят он продолжал неплохо играть в пинг-понг и очень расстраивался, когда мне проигрывал. Но зато он гораздо лучше меня ходил на ходулях, которые держал в гараже. А микроб теперь называется Trichoderma reesei.

Несколько слов о том, как устроена целлюлоза. Это почти бесконечно длинные цепи глюкозы, упакованные в столь же длинные продольные связки. Поэтому целлюлозные – и хлопковые – волокна такие прочные. Помните притчу про отца, который показывал сыновьям, что отдельные прутики сломать легко, но прутики в связке сломать гораздо труднее? Так вот, когда связка состоит из тысяч прутиков, то сломать ее почти невозможно. Это – хлопок. Можно разорвать, но с большим трудом. Более того, целлюлозные волокна в связке упакованы так плотно, что образуют почти идеально упорядоченную, то есть кристаллическую, структуру. Хлопковое волокно на 94–96 процентов является кристаллическим образованием. Потому и такое прочное.

Как же целлюлолитические микроорганизмы разрушают целлюлозу? Этот вопрос можно задать по-другому: куда деваются деревья, когда они стареют и в итоге падают? Дерево в лесу упало, прошли годы, десятилетия – куда оно делось? Если бы никуда не делось, мы за тысячи и миллионы лет были бы завалены деревьями «до небес».

А вот куда. На упавшее дерево перебираются целлюлолитические организмы из почвы, где их много, а также заносятся ветром – с грязью, с пылью. Оказавшись на дереве, эти «специализированные» микробы выделяют особые ферменты, называемые целлюлазами. Целлюлоза – субстрат, целлюлаза – фермент, то есть белок, обладающий особой каталитической активностью. Этот фермент «настроен» на расщепление химической связи между соседними звеньями глюкозы в целлюлозе и высвобождение самой глюкозы. Глюкоза – сахар, весьма питательный, и микроб этот сахар усваивает. Собственно, микроб и выделяет ферменты-целлюлазы именно для того, чтобы получить сахар и его усвоить. Это – основной продукт питания микроба. Поедая глюкозу, микроб растет, делится, размножается, производит (синтезирует) еще больше целлюлаз, выбрасывает их наружу, на поверхность дерева, и так происходит до тех пор, пока вся целлюлоза из дерева не выедена, не растворена, не усвоена микробом.

Правда, помимо целлюлозы древесина содержит еще лигнин – это твердая смола, которая пропитывает мягкую целлюлозу (помните, хлопок мягкий) и заставляет деревья стоять относительно прямо, – а также другие вещества. Но они тоже разрушаются и усваиваются другими ферментными системами. Лигнин усваивается труднее всего. Собственно, его природа и «изобрела» для предохранения целлюлозы. Вот такое сопряженное действие многих ферментов приводит к переходу древесины – вместе с расплодившимися за ее счет микробами – в почву.

Так что когда вы, бродя по лесу, случайно ступите ногой в остаток дерева или пня, мокрый и скользкий, то знайте: там пиршествуют специализированные микроорганизмы, участвуя в круговороте растительных веществ в природе. То же произошло и с хлопковым армейским обмундированием в тропиках на островах, просто такая легкая пища тамошним микробам «под руку» попалась, грех не съесть, лигнина-то нет.

За прошедшие с тех пор годы из микроорганизмов исследователи выделили десятки разных целлюлаз. В чистом, высушенном виде каждая из них представляет тонкий белый порошок, порошок белка. Этот порошок легко растворяется в воде, и при добавлении в полученный раствор целлюлозы она распадается под действием целлюлаз до глюкозы, или до коротких цепочек сахаров. Микробов нет, усваивать глюкозу некому, поэтому сахара остаются в растворе, и их можно либо высушить и получить как отдельный продукт, либо сбродить, например, дрожжами или другими микроорганизмами в спирты, аминокислоты, антибиотики и прочие полезные продукты. Это – основа биотехнологии целюлозы, или, другими словами, промышленного использования целлюлаз для получения полезных продуктов из целюлозосо-держащих веществ. Например из отходов или побочных продуктов сельского или лесного хозяйства.

Это все давно было известно исследователям, когда в конце 1970-х годов, после возвращения из США, я заинтересовался целлюлазами. А заинтересовался потому, что уже лет тридцать, с первых детальных опытов армейских лабораторий США, оставалась нерешенной принципиальная загадка ферментов-целлюлаз. Впервые ее сформулировал в конце 40-х годов тот же Элвин Риз. Было найдено, что ферменты по-разному разрушают целлюлозу. «Легкоусвояемую», аморфную целлюлозу, из которой состоит фильтровальная бумага, легко разрушают все активные целлюлазы, переводя ее в глюкозу. А вот кристаллическую целлюлозу в хлопке разрушают буквально единицы. Хоть добавляй их к хлопку килограммами. В чем дело? Никто ответа не знал.

Исходя из этого, еще в конце 1940-х годов Риз подразделил все целлюлазы на «хорошие» и «плохие», или на «полноценные» и «неполноценные».

По отношению к аморфной целлюлозе (то есть не содержащей кристаллов целлюлозы) как «полноценные», так и «неполноценные» вели себя одинаково. Бросишь щепотку тех или других в стаканчик с водой, в которой плавают кусочки фильтровальной бумаги, – и бумага постепенно растворяется. Если в стаканчик с водой добавить щепотку хлопка и бросить туда же щепотку «полноценных» целлюлаз, хлопок тоже растворится, хотя и медленнее. А бросишь туда «неполноценных» целлюлаз, хоть щепотку, хоть полстакана, да хоть лопату, – хлопок так и останется нетронутым. Почему? Никто не знал.

В начале 1950-х годов Элвин Риз предположил, что «полноценные» целлюлазы содержат некий «фактор», которого нет в целлюлазах «неполноценных», собственно, отсюда и разные названия двух типов целлюлаз. Напомню, что «фактором» в биохимии называют то, природа чего неизвестна. «Фактор» есть, а слова нет. Так и приняли в мировой научной литературе по целлюлазам, потому что ничего другого, кроме «фактора», никто больше предложить не смог.

Мне эта идея про «фактор» сразу не понравилась. Сразу – это по прошествии почти тридцати лет после того, как эта идея была введена и принята. Сразу – это как только я о «факторе» узнал. В самом деле, при чем здесь «фактор»? Целлюлазы-то очищенные, ничего другого там просто быть не может. Что за мистика такая – «фактор»? Не зря же я столько времени занимался субстратной специфичностью ферментов, чтобы понимать, что тут не некий «физический фактор» должен присутствовать, а должна быть разная специфичность «хороших» и «плохих» целлюлаз. Только как ее нащупать?

И взялся я за это дело. Тандемом с моим ближайшим сотрудником Мишей Рабиновичем, который в итоге за эти разработки получил премию Ленинского комсомола, разделив ее с моими же учениками Аркадием Синицыным, Володей Черноглазовым и Сашей Морозовым. Премию им присудили за то, что на основании нашей с Рабиновичем разгадки про «фактор» они создали принципиально новый тип реактора для ферментативного гидролиза целлюлозы в глюкозу. А мне за это в совокупности с другими работами по ферментам присудили Госпремию СССР по науке и технике, а также золотую медаль ВДНХ – за реактор, теоретическое описание принципов его действия и практическую демонстрацию действия.

Загадку мы разгадали. Не зря нас физической химии учили и заложили основы «физико-химического мышления». Этот якобы «фактор» действительно оказался свойством целлюлаз, определяющим их специфичность, а именно способностью ферментов адсорбироваться на целлюлозе. Для гидролиза аморфной целлюлозы способность целлюлаз на ней адсорбироваться оказалась особенно не нужна: материал легкий, связи между глюкозными группами доступны, соударение фермента с целлюлозой обычно ведет к расщеплению очередной глюкозной связи. Другое дело с целлюлозой кристаллической.

Цепи там так плотно упакованы, что фермент при простом соударении между ними не пролезает. Вода и то не пролезает, а уж крупный белок и подавно. Целлюлаза должна прочно адсорбироваться на поверхности кристаллической целлюлозы и использовать энергию адсорбции для понижения энергетического барьера реакции ферментативного гидролиза. Это если по-научному.

А если по-простому – у «плохой» целлюлазы, которая плохо адсорбируется, «зубы соскальзывают», кристалл не «укусить». Только со-ударилась – тут же отскочила. Не успевает целлюлозу атаковать, на это ей время нужно. А у «хорошей» целлюлазы, которая прочно на поверхности кристалла зацепилась, есть возможность «укусить» посильнее. Она не отскакивает, а латерально дрейфует по поверхности кристаллической целлюлозы, атакуя ее опять и опять. И щеплет связь за связью, производя глюкозу. Реакция ускоряется в миллионы раз. Поэтому и реактор мы сделали на основании свойства целлюлаз адсорбироваться и гидролизовать целлюлозу в адсорбированном состоянии. До нас про адсорбцию целлюлаз речи вообще не было.

Кстати, про наши работы в этой области и про новый реактор была большая статья в «Правде» в ноябре 1983 года. Под довольно глупым названием «Сладкий лес». Но это уже на совести тех, кто статью писал и публиковал.

Поскольку тема биотехнологии целлюлозы была и остается важной, я много ездил с докладами об этом, благо к тому времени мой невыездной статус закончился. Рулить страной начал М.С. Горбачев, и ситуация с выездами стала потихоньку меняться. Лекции по целлюлазам и технологии превращения целлюлозы в сахара я читал на Кубе, и не только читал, но и изучал там целлюлазы океанских моллюсков, о чем расскажу отдельно, а также в Индии, во Вьетнаме (они тогда хотели получать сахара из эвкалиптов с помощью целлюлаз), во Франции, Италии, Финляндии, Швеции, Канаде, в Университете Беркли в США, Принстонском и Корнельском университетах, Университете Ватерлоо в Канаде, в Окриджском научном центре в Теннесси и во всех, наверное, соцстранах Восточной Европы. Помимо этого, отдел промышленного развития ООН заказал мне книгу на эту тему, которую они и опубликовали в 1984 году. За что неплохо заплатили, по тем временам для Союза деньги были вообще фантастические.

Всего по целлюлазам я опубликовал более сотни статей, из них много по адсорбции ферментов, раскручивая это явление и его каталитические следствия шаг за шагом. Собственно, на упомянутых лекциях по целюлазам я обкатывал теорию, чему очень помогали вопросы из аудитории и дискуссии. Особенно со специалистами по целлюлазам и в компаниях «Форинтек» (Канада) и «Джененкор» (Сан-Франциско), где велись и продолжают вестись коммерческие разработки на эту тему.

Точку в этом вопросе поставила моя итоговая статья в ведущем международном научном журнале «Biochemistry» в 1990 году. В этой статье на многих примерах показано, как с ростом адсорбционной способности целлюлаз последовательно растет их способность всё быстрее и быстрее разрушать кристаллическую целлюлозу. И там я объявил, что вопрос с «фактором» можно успешно и бесповоротно закрывать. Редакция поместила эту статью первой в выпуске, под шапкой «Перспективы биохимии». Статья собрала несколько сотен цитирований в публикациях на эту тему. Это, пожалуй, моя наиболее цитируемая в научной печати статья из почти трехсот опубликованных. И наверное, наиболее мне дорогая. Больше по этой теме я статей не публиковал. Для меня вопрос был исчерпан. Но еще немало лет, уже будучи в США и работая совсем по другой тематике, я продолжал получать приглашения читать лекции на тему механизма действия целлюлаз в самых разных университетах и компаниях США и Канады. И не только там, но и, например, во Всемирном банке (The World Bank) в Вашингтоне, и в парламенте Канады (House of Commons) в Оттаве. Я каждый раз ехал и выступал. Тема уж очень интересная. А в Гарвардском университете мне специально предоставили возможность – уже в середине 1990-х годов – написать шеститомник по инженерной энзимологии, в котором особое внимание уделить целлюлазам и биотехнологии целлюлозы.

Про выступление в канадском парламенте, пожалуй, расскажу отдельно. История того стоит, наверное.

Оглавление книги